Vatikan Müzeleri'nin içinde ziyaretçiler, sanat tarihinin farklı bir bölümünü ortaya çıkaran birbirine bağlı geniş saraylar, galeriler, koridorlar ve avlular ağında ilerler. Sistine Şapeli, tartışmasız en önemli yerdir; Michelangelo'nun tavanı ve sunak duvarı, eşsiz yoğunluğuyla mekana hakimdir. Yakınlardaki Raphael Odaları, Rönesans'ın en etkili fresklerinden bazılarını, özellikle de ünlü Atina Okulu'nu sergiliyor.
Haritalar Galerisi, İtalya'nın 16. yüzyıldan kalma detaylı freskli haritalarıyla kaplı 100 metreden daha uzun bir alana yayılırken, Pio-Clementine Müzesi, Batı sanatını şekillendiren ikonik klasik heykelleri sunuyor. Mısır ve Etrüsk Müzeleri gibi ek bölümler, antik uygarlıklara dair içgörüler sunarken, Pinacoteca ortaçağ döneminden 19. yüzyıla kadar önemli resimleri sergiliyor. Müzeler boyunca, duvar halıları, avlular ve mimari detaylar ziyarete ritim ve çeşitlilik katarak koleksiyonun büyüklüğünü ve kültürel önemini pekiştiriyor.